PEMBUATAN MEDIA dan STERILISASI MEDIA

  PEMBUATAN MEDIA dan STERILISASI MEDIA

I.                   PENDAHULUAN

Media kultur banyak sekali jenisnya, antara lain woody plant medium (WPM) yang biasanya digunakan untuk kultur tanaman kehutanan, Vaant and went (VW) untuk tanaman anggrek, white biasanya digunakan untuk kultur akar, Seenck and Hildabrant (SH), dan Marashige and Skoog (MS) yang akan digunakan pada kegiatan praktikum.Untuk membuat suatu media diperlukan beberapa komponen umum, antara lain: hara makro, hara mikro, asam amino dan N organik, gula, senyawa kompleks alami, vitamin, buffer, arang aktif, ZPT, dan bahan pemadat. Untuk membuat media MS dapat dipergunakan larutan stok yang telah dibuat dan dipersiapkan sebelumnya, penggunaan larutan stok ini dapat mempermudah dan mempercepad dalam pembuatan media MS.

Selain peralatan kultur jaringan, media merupakan salah satu faktor utama dalam keberhasilan kultur. Media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam.Media kultur jaringan memiliki karakteristik masing-masing. Artinya tidak semua media dapat digunakan pada semua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada memiliki perbedaan kandungan dan konsentrasi zat-zat yang diperlukan atau digunakan pada kultur.Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kultur jaringan banyak ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam. Campuran media yang satu, dapat cocok untuk jenis tanaman tertentu, tetapi dapat kurang cocok untuk jenis tanaman yang lain.Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsure murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades.

Untuk memenuhi faktor pertumbuhan tanaman, media kultur jaringan yang baik mengandung:
1. Hara anorganik. Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan normal dalam kultur jaringan, unsur – unsur penting ini harus dimasukkan dalam media kultur.
2. Hara organik. Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof dan dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting.

3. Sumber karbon. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energy bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh.

4. Agar. Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel. Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7 – 1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk.
5. pH. media biasanya diatur pada kisaran 5.6 – 5.8 tapi tanaman yang berbeda mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat.
6. Zat Pengatur Tumbuh. Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur tumbuh.

7. Air. menggunakan aquades (air destilata ganda).

8. Pemilihan Media. mulai dengan media MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Media kultur jaringan memiliki karakteristik masing-masing. Artinya tidak semua media dapat digunakan pada semua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada memiliki perbedaan kandungan dan konsentrasi zat-zat yang diperlukan atau digunakan pada kultur.

1.1. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan pada hari Selasa, 8 Oktober 2011 di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Universitas Jambi.

1.2. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk Mengetahui dan mempraktikan cara membuat medium MS (Murashige & Skoog) dengan baik dan benar serta untuk sterilisasi media.

II.        METODE PELAKSANAAN

2.1. Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan pada pemssbuatan media ini adalah batu stirel, timbangan analitik, tabung Erlenmeyer, gelas ukur dan pipet tetes, pengaduk, hot Plat, pH meter, botol kultur, autoklaf, Plastik bening tahan panas dan karet gelang.Sedangkan bahan yang digunakan adalah stok (A,B,C,D,E,F), Agar-agar 3,5 gram, Gula 15 gram.

2.2. Prosedur Kerja

2.2.1. Pembuatan Media kultur Marashige and Skoog (MS).

Gambar 1.1. Aquades Sebanyak 500 ml dipersiapkan didalam Gelas Piala masukkan batu stirel dan larutan stok A, B, C, D, E, dan F dimasukkan kedalam Gelas Piala sesuai dengan yang dibutuhkan.

Gambar 1.2. 15 gr sucrosa ditambahkan ke dalam gelas piala dan biarkan sampai homogen.

s                  

Gambar 1.3. Larutan media dimasak dengan autoflate dan ditambahkan 3,5 gr agar-agar.

Gambar 1.4. pH media diukur dengan pH meter yaitu dengan memasukkan sensor ke dalam larutan media. Jika kurang dari 5,6-5,8 ditambahkan larutan NaOH dan jika lebih ditambahkan larutan HCL.

Gambar 1.6.Media dimasukkan ke dalam botol kultur Kira-kira tingginya 2-3 cm, kemudian botol kultur ditutup dengan menggunakan palstik bening tahan panas.

2.2.2. Pembuatan Media woody plant medium (WPM)

1.      Timbang  masing-masing stok

-          Stok A : 2,42 ml                     

-          Stok B : 25 ml

-          Stok C : 25 ml

-          Stok D : 25 ml

-          Stok E : 25 ml

-          Stok F : 5 ml

2.      Gula 15 gram dan Agar 3,5 gram.

3.      Letakkan gelas piala berisi spiral (pemutar) ke atas pemanas (hotplate)

4.      Masukkan semua stok yang telah di timbang (A,B,C,D,E,F) ke dalam gelas piala ditambah dengan aquades hinggal 500 ml.

5.      Panaskan semua larutan diatas hotplate dan spiral akan memutar secara otomatis.

6.      pH media diukur dengan pH meter yaitu dengan memasukkan sensor ke dalam larutan media. Jika kurang dari 5,6-5,8 ditambahkan larutan NaOH dan jika lebih ditambahkan larutan HCL.

2.2.3.Pembuatan Media Vaant and went (VW)

1.      Timbang bahan

-          (NH4)2NO3 : 1 gram

-          KnO3 : 1 gram

-          KH2PO4 : 0,5 gram

-          MgSO4.7H2O : 0,5 gram

-          MnSO4.4H2O : 0,000014 kg

-          Agar : 14 gram

-          Gulaku : 40 gram

-          Stok F : 10 ml

-          Stok D : 10 ml

2.       Air kelapa muda 500 ml

-          Untuk 10%  x 500 = 50 ml

-          Untuk 20% x 500 = 100 ml

-          Untuk 30% x 500 =150 ml

-          Untuk 40% x 500 = 200 ml

3.      Campurkan semua bahan yang telah di timbang di tambah aquades 2000 ml dan panaskan dengan hoplate.

2.2.4..Sterilisasi media

Botol yang sudah berisi medium, dimasukan kedalam autoklaf untuk disterilisasi pada suhu 1210C dengan tekanan 15-17,5 psi selama 20 menit.Setelah selesai sterilisasi, botol disimpan diruangan yang sejuk.

                                   

botol-botol yang sudah diisi media                  botol di masukkan ke autoclave untuk di sterilisasi 

Posisi botol berada dalam autoclave kemudian autoclave di tutup rapat.

III.       HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

3.1. Hasil Pengamatan

Media kultur yang baik, selain dapat menyediakan seluruh kebutuhan tanaman juga harus steril dari kontaminasi.Media Murashige & Skoog, Media Vaant and went (VW), Media woody plant medium (WPM) dalam praktikum ini semua media berhasil ditandai dengan media yang padat yaitu tidak mengalami pengenceran.

3.2. Pembahasan

Pembuatan media harus berdasarkan perhitungan konsentrasi yang tepat. Karena akan mempengaruhi keberhasilan tumbuh eksplan. Media yang digunakan merupakan media Ms (Murashige dan Skoog). Pada proses pembuatannya mencampurkan stok A,B,C,D,E,F. Ditambakan pula sukrosa yang bertujuan untuk memberikan bahan baku metabolisme eksplan karena eksplan belum mampu menghasilkan asimilat seperti tumbuhan pada umumnya. Selanjutnya ditambahkan pemadat berupa agar “swallow” untuk memadatkan media.

IV.       KESIMPULAN

Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa:

1. Pembuatan medium MS dilakukan dengan mencampurkan stok yang telah dibuat. Untuk pembuatan 1L medium, maka stok unsure makro diambil sebanyak 100 ml, stok unsure mikro diambil 5 ml, stok Fe diambil 5 ml, stok vitamin diambil 50 ml, stok ZPT untuk auksin dan sitokinin masing-masing 1 ml.

2. Sterilisasi medium dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C pada tekanan 15-17,5 psi selama 20 menit.